La chiesa, officiata il 7 luglio del 1562, iniziò a essere costruita dal Vasari il 17 aprile del 1565, dove anticamente sorgeva la chiesa di San Sebastiano alle Fabbriche Maggiori. Questa chiesa fu voluta da Cosimo I de’Medici come Collegiata dell’Ordine Militare e Cavalleresco di Santo Stefano, papa e protomartire cristiano. La facciata, iniziata dal Vasari stesso, fu completata su progetto e disegno di Giovanni de’Medici. In origine era a una sola navata, cui furono aggiunte nel secolo XVII le due navate laterali, completate nel 1934. L’interno della chiesa conserva al suo interno cimeli, bandiere e fanali sottratti alle navi turche e pirate nel corso dei secoli XVI – XVIII. Il grande soffitto ligneo presenta opere dedicate alle imprese ed alla gloria dell’Ordine di Santo Stefano.