Nato da Luigi Pacinotti e Caterina Catanti, frequentò l’istituto arcivescovile Santa Caterina e nel 1859 prese parte alla Seconda guerra di indipendenza come sergente volontario. Fu allievo di Carlo Matteucci, si laureò in matematica con Riccardo Felici e ottenne la cattedra di fisica a Bologna, dove insegnò dal 1865 al 1873. Tra i suoi allievi vi fu Augusto Righi. Dopo un incarico a Cagliari, nel 1881 passò all’Università di Pisa, dove prese il posto del padre Luigi sulla cattedra di fisica tecnologica.
L’invenzione della dinamo risale al 1858, mentre la creazione del primo esemplare, realizzato presso il laboratorio del padre, al 1860.
Nel 1883 divennè socio dentista dell’Accademia dei Lincei e, nel 1898, socio nazionale. Nel 1888 aderì alla Società dei XXXL, e nel 1905 fu nominato senatore del Regno d’Italia.
Al nome di Pacinotti è dedicato il Liceo scientifico della Spezia e di Cagliari, l’Istituto Tecnico per Geometri statale di Bologna, gli I.T.I.S. di Taranto e di Scafati e l’I.P.S.I.A. di Pontedera.